Profil des candidat(e)s :
- Niveau M2 ou ingénieur, diplôme étranger équivalent obtenu dans l’année universitaire 2012-2013
- Compétences souhaitées : formation de base en biochimie et chimie analytique
Etablissement d’accueil : Chimie Paris Tech
Contacts :
- Dr. Fethi Bedioui (fethi-bedioui@chimie-paristech.fr), tél. 33 (0) 1.44.27.64.89
- Pr. Anne Varenne (anne-varenne@chimie-paristech.fr) tel. 33 (0) 1.43.25.18.76
- Dr Sophie Griveau (sophie-griveau@chimie-paristech.fr) tél. 33 (0)1.44.27.64.93
- Dr Fanny d’Orlyé (fanny-dorlye@chimie-paristech.fr) tel. 33 (0) 1.44.7.64.92
Contexte et challenges :
Le monoxyde d’azote, NO, est produit dans le corps humain au niveau vasculaire, neuronal et du système immunitaire, agissant comme messager cellulaire (régulation du tonus vasculaire, neurotransmission) et agent cytotoxique (réponse immunitaire)[i],[ii],[iii]. Ses effets biologiques dépendent de ses taux de production, une surproduction ou sous-production induisant des dysfonctionnements biologiques tels l’angine de poitrine[iv]. Aussi, une meilleure compréhension des rôles de NO requiert des mesures sensibles, sélectives et en temps réel de NO ou de ses métabolites biologiques. NO est cependant un radical possédant une durée de vie assez courte in vivo et, dans le système vasculaire, une large partie du NO produit étant convertie en différents S-nitrosothiols (RSNOs), par réaction avec des petits thiols tels que la cystéine et le gluthathion et les fonctions thiols des protéines telles que l’albumine (Figure 1). Les RSNOs sont relativement stables in vivo et apparaissent comme des formes de stockage et de transport de NO dans le sang et le plasma, permettant à NO de diffuser in vivo sur des distances importantes.
L’évaluation des taux de RSNOs in vivo est extrêmement difficile à cause de la diversité des RSNOs formés, de faible et haut poids moléculaires, et de la présence d’autres biomolécules potentiellement interférentes. La seconde difficulté concerne la dégradation des RSNOs une fois extraits de leur environnement biologique naturel, nécessitant des précautions dans la préparation des échantillons. Malgré des avancées techniques et méthodologiques significatives concernant la détection de RSNOs [v],[vi],[vii],[viii], la quantification et la détection simultanée de NO et des thiols libérés constitue un challenge, car les RSNOs sont détectés indirectement en les décomposant en NO et thiols (oxydé et réduit). Actuellement il n’existe pas de méthode standard pour détecter les diverses formes de RSNOs présents dans les fluides biologiques.
Ainsi nous proposons l’élaboration d’un dispositif miniaturisé doté d’un procédé de décomposition original des RSNOs et d’un détecteur sensible et sélectif permettant la détection et la quantification des différentes formes de RSNOs de haut et bas poids moléculaires dans les fluides biologiques complexes.
Projet :
L’objectif du projet est de concevoir un dispositif analytique miniaturisé permettant la séparation simultanée, la détection et la quantification des RSNOs de faible (<500 Da) et haut poids moléculaires (>10 kDa) présents dans des fluides biologiques ainsi que la caractérisation de leurs produits de décomposition, RSH (ou RSSR sous sa forme oxydée) et NO.
Les méthodes électrocinétiques capillaires classiques ont montré leur intérêt pour le suivi in vitro de réactions de dégradation moléculaires des RSNOs (S-nitroso-cystéine[ix], -glutathion[x],[xi]), permettant la séparation en milieu libre et la détection UV en ligne des trois métabolites RSNO, RSH et RSSR dans des échantillons biologiques. Des mélanges modèles de différents thiols de faibles poids moléculaires (homocystéine, cystéine et glutathion) et de leurs dérivés S-nitrosylés ont également pu être séparés dans les mêmes conditions[xii]. Enfin, la S-nitroso-albumine a été caractérisée par électrophorèse capillaire en gel de dextran avec détection de fluorescence[xiii]. Néanmoins les familles de protéines S-nitrosylées de hauts poids moléculaires présentes dans des échantillons biologiques n’ont pas pu être séparées dans ces conditions.
Dans le cadre de ce projet de thèse, nous proposons de transposer et d’optimiser cette approche en microcanal pour développer des analyses ultra-rapides (< 1min), compatibles avec la durée de vie de NO, faiblement consommatrices en échantillons biologiques, et permettant l’injection séquentielle ou le traitement en parallèle de plusieurs échantillons. NO et les donneurs de NO sont électroactifs et peuvent être directement oxydés ou réduits sur différentes électrodes. Ce travail s’orientera donc vers le couplage des méthodes électrocinétiques à une détection électrochimiques sélective, sensible et ne nécessitant aucune étape de dérivation préalable. Avec la détection électrochimique, il sera par ailleurs possible d’intégrer les électrodes dans le microcanal pendant le procédé de microfabrication[xiv],[xv], conduisant ainsi à des systèmes microfluidiques entièrement intégrés[xvi],[xvii],[xviii],[xix].
Ce type de dispositif (Figure 2) a déjà fait ses preuves pour l’étude du comportement dynamique de donneurs de NO[xx]. Dans le cadre de cette thèse, nous envisageons l’étude des RSNOs comme systèmes modèles de transport et de délivrance de NO afin de mieux comprendre les mécanismes in vivo. Leur coupure homolytique en NO et thiol sera induite selon plusieurs voies : (1) photochimique (2) catalytique (par Cu+) ou (3) thermique. Cette décomposition sera réalisée soit dans le puits en entrée de canal, soit à une distance finie du canal, à proximité du dispositif électrochimique de détection. Une détection ampérométrique directe et/ou indirecte pourra être envisagée dans une configuration originale à trois électrodes permettant de détecter et quantifier simultanément, après leur séparation, les RSNOs et/ou leurs produits de dégradation, RSH (ou RSSR sous sa forme oxydée) et NO. Le dispositif de détection des RSNOs fera donc l’objet d’un travail de conception important.
Les conditions optimales de prélèvement, de conservation et de pré-traitement des échantillons biologiques avant leur analyse seront étudiées afin d’éviter des artefacts de mesure liés à des dégradations et/ou formations d’espèces lors de ces différentes étapes.
Le travail sera d’abord mené sur des échantillons artificiels, afin d’optimiser les paramètres de séparation des différents RSNOs de bas et haut poids moléculaires. Puis le système développé sera appliqué à l’analyse d’échantillons biologiques réels tels que le plasma et le sang.
- [i] L. J. Ignarro et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 218 (1981) 739-749.
- [ii] L. J. Ignarro et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 84 (1987) 9265-9269.
- [iii] R. F. Furchgott, Angew. Chem.-Int. Edit., 38 (1999) 1870-1880.
- [iv] G. Thomas, Medicinal Chemistry, An introduction, Wiley, 2007.
- [v] D. Giustarini at al., J. Chromatogr. B, 851 (2007) 124-139.
- [vi] A. Gow et al., J. Chromatogr. B, 851 (2007) 140-151.
- [vii] E. Bramanti, et al., Life Sciences, 88 (2011) 126-129.
- [viii] E. Bechtold and S. B. King, Antioxid. Redox Signaling, 17 (2012) 981-991.
- [ix] F. Misiti et al., BBRC, 294 (2002) 829-834.
- [x] C. Carru et al., J. Chromatogr. A, 1017 (2003) 233-238.
- [xi] I. Messana et al., Electrophoresis, 21 (2000) 1606-1610.
- [xii] J. S. Stamler et J. Loscalzo, Anal. Chem., 64 (1992) 779-785.
- [xiii] S. Wang et al., J. Chromatogr. A, 1218 (2011) 6756-6762.
- [xiv] D. B. Gunasekara et al., Electrophoresis, 32 (2011) 832-837.
- [xv] M. K. Hulvey et al., Anal. Chem., 82 (2010) 1608-1611.
- [xvi] R. S. Martin, Methods Mol. Biol., 339 (2006) 85-112.
- [xvii] P. Kuban and P. C. Hauser, Electrophoresis, 30 (2009) 3305-3314.
- [xviii] M. Pumera, et al., TrAC Trends Anal. Chem., 25 (2006) 219-235.
- [xix] C. D. Garcia and C. S. Henry (2007) Coupling Electrochemical detection with microchip capillary electrophoresis. CRC, Boca Raton, pp265-297.
- [xx] B. Gunasekara, Anal. Bioanal. Chem., 403 (2012) 2377-2384.